| Tartu Tervishoiu Kõrgkool Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat | ||
| Koostas: | Reimo Lehtmets | Kuupäev 03.12.2016 |
| Kinnitas: | Eerik Jõgi | Kuupäev 12.01.2017 |
4.2.1 MEETODI ULATUS
In Vitro meetod: Inimese verest desoksüribonukleiinhappe (DNA) eraldamise juhend välja-soolamise meetodiga.
4.2.2 MEETODI KEHTIVUS
Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH
Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH
Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI
4.2.3 EESMÄRK
Käesolev metoodiline juhend on ettenähtud inimeste verest DNA eraldamiseks Tartu Tervishoiu Kõrgkooli molekulaardiagnostika õppelaboris kasutamiseks.
Inimese verest DNA eraldamist kasutatakse inimese DNA kättesaamiseks, et teostada eraldatud DNA-st vajalikke molekulaardiagnostilisi analüüse.
4.2.4 VAJALIKUD TÖÖVAHENDID
- 2,0 ml mikrotuubid (joonis 1) ja nendele sobiv statiiv
- automaatpipetid mahuga 100–1000 μL ja 20−100 μL
- mikrotsentrifuug
- mikrotuubide termostaat
- segaja (vortex)
- jäätmete konteinerid
- kaitsevahendid (kummikindad)
- jää – koos jääd hoidva alusega
*Peale proteiinide sadestamist võib kasutada ka 1,5 ml mikrotuubi (joonis 1)
4.2.5 VAJALIKUD LAHUSED JA PUHVRID
- puhver A (erütrotsüütide lüüsimispuhver) 100 ml lahus
- 0,32 M sahharoos
- 10 mM Tris-HCl
- 5 mM MgCl2
- 0,75% Triton-X-100
- puhver B (leukotsüütide lüüsimispuhver)
- 20 mM Tris-HCl
- 4 mM Na2EDTA
- 100 mM NaCl
- isopropanool ja 70% etanool
- deioniseeritud (MilliQ) vesi (hoida jää peal jahedana)
- naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) 10% lahus
- proteinaas K töölahus (kontsentratsiooniga 50−400 μg/ml)
- 5,3M NaCl lahus
- TE puhver
- 10 mM Tris-HCl
- 1 mM EDTA
4.2.6 PROOVIMATERJAL JA SÄILITAMINE
Proovimaterjal (veri) peab olema kogutud EDTA (lilla korgiga) katsutisse (joonis 2).
Vajadusel on võimalik käesoleva juhendiga eraldada DNA-d ka kapillarverest, mis on kogutud mikro-EDTA katsutitesse. Sobib ka veri, mis on võetud samal päeval, mil hakatakse DNA-d verest eraldama. EDTA-veresid säilitada külmkapis madala temperatuuri juures (soovitavalt 4 °C juures) maksimaalselt üks nädal.
4.2.7 TÖÖOHUTUS JA TÖÖALANE TEAVE
Vajalik on kasutada enesekaitsevahendeid (kummikindad), sest inimese veri on potentsiaalselt nakkusohtlik materjal, millega tuleb vastavalt labori ohutusnõuetele ümber käia. Sama kehtib ka tööks vajaminevate lahuste ja reagentide kohta. Lisaks on kummikinnaste kasutamine oluline, et DNA eraldamise protseduuride käigus vältida tarvikute, lahuste ja katsutite saastumist võõra DNA-ga (kätelt eralduvad mikroobid).
Tööprotsessi käigus tuleb kõik verega ja kemikaalidega määrdunud tarvikud visata ettenähtud jäätmetekogumis konteinteritesse.
4.2.8 SOOVITUSED
- Esimest erütrotsüütide lüüsimispesu tehes ja supernatandi eraldades ei ole enamasti selgelt näha mikrotuubi põhjas leukotsüütide sadet (joonis 3) – jätta mikrotuubi põhja natuke supernatanti, et vältida leukotsüütide välja pipeteerimist. Järgnevate erütrotsüütide lüüsimispesudega on supernatandi pipeteerimisel sadet lihtsam jälgida.
- Mikrotuube on soovituslik asetada tsentrifuugi kindla küljega väljapoole. Mikrotuubi sein, mis jääb tsentrifuugis välja poole, hoiab enda küljes peale tsentrifuugimist leukotsüütide sadet – supernatandi eemaldamisel on sadet lihtsam tuvastada. Eelnev kehtib ka DNA sadestamisel.
- DNA-d etanoolist kuivatamisel saab kasutada ka mikrotuubide termostaati. Sel juhul asetada mikrotuub lahtise kaanega termostaati 37 °C juurde, et etanool ära aurustuks.
Kasutada termostaadis DNA kuivatamist maksimaalselt 2−3 minutit.
4.2.9 TÖÖKÄIK
Enne tööle asumist teha vajalikud ettevalmistused – vajadusel valmistada lahused, valmis seada vajalikud töövahendid (4.2.4 peatükk) ja veri, millest DNA-d hakatakse eraldama.
Erütrotsüütide lüüsimine:
- pipeteerida EDTA katsutist 500 μL homogeniseeritud verd steriilsesse 2 ml mahuga mikrotuubi.
- Soovitavalt märgistada markeriga enda mikrotuub, et seda hiljem tsentrifuugist lihtsam tuvastada oleks.
- pipeteerida mikrotuubi verele 500 μL Puhvrit A ja 500 μL külma deioniseeritud vett, segada proovi käes, pöörates mikrotuubi 7−8 korda.
- inkubeerida proovi jääl 2−3 minutit.
- tsentrifuugida proovi mikrotsentrifuugis 3500 rpm juures 3 minutit.
- Soovituslik on asetada mikrotuub tsentrifuugi kindla küljega väljapoole. Mikrotuubi sein, mis jääb tsentrifuugis välja poole, hoiab enda küljes peale tsentrifuugimist leukotsüütide sadet (joonis 3) – supernatandi eemaldamisel on sadet lihtsam tuvastada.
- pipeteerida proovilt ettevaatlikult supernatant pealt ära, jättes mikrotuubi põhja alles leukotsüütide sademe.
- Mikrotuubi põhja jätta natukene supernatanti, et vältida leukotsüütide sademe välja pipeteerimist.
- Järgnevate erütrotsüütide lüüsimispesudega muutub sade paremini nähtavamaks.
- sademele lisada mikrotuubi uuesti 500 μL puhvrit A ja 1000 μL külma deioniseeritud vett. Segada proovi vorteksil 15−30 sekundit.
- tsentrifuugida 3500 rpm juures 3 minutit.
- tsentrifuugitud proovilt pipeteerida pealt supernatant, jättes alles sademe tuubi põhja. Peale supernatandi eemaldamist korrata pesu ehk 5.−8. tööetappi.
- Leukotsüütide sade peab olema enam-vähem valkjas valge ja selge (ei tohiks sisaldada erütrotsüütide jääke ehk sade ei tohi olla punaka tooniga), vastasel juhul korrata veelkord pesu ehk 5.−8. tööetappi.
Leukotsüütide, rakutuumade lüüsimine:
- lisada mikrotuubi sademele 500 μL Puhvrit B. Segada proovi vorteksil 30 sekundit, et sade lahuses suspendeeruks.
- lisada proovile 15 μL värsket Proteinaas K-d (töölahus) ja 50 μL 10 % SDS lahust ning segada proovi käes üles-alla pöörates. Mikrotuub asetada termostaati inkubeerima 30−60 minutiks 55 °C juurde.
- NB! Jälgida, et mikrotuubi kaas oleks termostaadis suletud!
- asetada mikrotuub jääle jahtuma 2−3 minutiks.
Proteiinide sadestamine:
- lisada proteiinide sadestamiseks mikrotuubi 400 μL 5,3 M NaCl lahust ning segada vorteksi peal 15 sekundit.
- tsentrifuugida proovi maksimaalpöörete juures 5 minutit.
- ettevaatlikult pipeteerida proovi supernatant uude mikrotuubi nii, et mikrotuubi põhjast sadet kaasa ei tuleks.
- Siinkohal saab kasutada ka 1,5 ml mikrotuubi (joonis 1), mis on kitsama põhjaga. Sel juhul märgistada uuesti enda mikrotuub, et hiljem tsentrifuugis lihtsam tuvastada oleks.
DNA sadestamine:
- DNA sadestamiseks lisada mikrotuubi eraldatud supernatandile 0,8 korda supernatandi kogusest või võrdne kogus isopropanooli. Segada mikrotuubi käes pöörates 7−8 korda.
- Näitena 600 μL supernatandile lisada 600 x 0,8 või 600 μL isopropanooli.
- DNA peaks isopropanoolis esile kerkima lima-taolise väikse niidina (ei ole alati silmaga nähtav).
- tsentrifuugida proovi täispöörete juures 10 minutit, et DNA mikrotuubi põhja sadestada.
- eemaldada automaatpipetiga mikrotuubist supernatant. Pipeteermisel jälgida, et mikrotuubi põhjast DNA-d kaasa ei tuleks.
DNA puhastamine kaasa tulnud sooladest:
- lisada mikrotuubi 1000 μL 70% etanooli, segada tuubi aeglaselt käes üles-alla, pöörates 6−8 korda.
- tsentrifuugida proovi täispöörete juures 7 minutit, et DNA mikrotuubi põhja sadestada.
- automaatpipetiga eemaldada mikrotuubist 70% etanool ning asetada mikrotuub avatud kaanega õhu kätte kuivama, et aurustuksid ülejäänud 70% etanooli jäägid.
- Mikrotuubi on võimalik ettevaatlikult asetada avatud kaanega tagurpidi (mikrotuubi ava all pool) kuivatuspaberile kuivama.
- Etanooli jääkide kuivatamisel saab kasutada ka mikrotuubide termostaati 37 °C juures maksimaalselt 2−3 minutit. Jälgida, et mikrotuubi kaas oleks sel juhul avatud!
- kuivanud DNA-le lisada mikrotuubi resuspendeerimiseks 100 μL TE puhvrit. Lasta DNA-l resuspendeeruda ööpäev 4−8 °C külmkapis. Lahustunud DNA-d võib säilitada külmkapis 4–8 °C juures, kuid soovitavalt -20 °C külmikus.
* Kui DNA on TE puhvris lõpuks resuspendeerunud, siis on soovitatav kontrollida oma genoomse DNA saagise kvaliteeti 0,8%−1,0% agaroosgeelil, tehes geelelektroforeesi analüüsi. Agaroosgeelile kanda 5 μL enda DNA lahust, mida tuleb eelnevalt DNA laadimisvärviga segada. Lisada esimesse agaroosgeeli auku 2 μL 1 kb suurusmarkerit.
