4.1 FAKTOR V LEIDENI MUTATSIOONI MÄÄRAMINE PCR-RFLP MEETODIL   

Tartu Tervishoiu Kõrgkool Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat 
Koostas: Kätlin Karlson Kuupäev 12.01.2016 
Kinnitas: Eerik Jõgi Kuupäev 12.01.2016 

4.1.1 MEETODI ULATUS

In Vitro meetod:  Faktor V Leideni mutatsiooni määramine PCR-RFLP meetodil 

4.1.2 MEETODI KEHTIVUS

Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH 

Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH 

Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI 

4.1.3 MEETODI EESMÄRK

Käesolev juhend on mõeldud faktor V Leideni mutatsiooni olemasolu määramiseks Tartu Tervishoiu Kõrgkooli geneetika ja molekulaardiagnostika õppelaboris. Faktor V Leideni mutatsioon on pärilik häire, mida iseloomustab puudulik vastus aktiveeritud proteiin C-le. Mutatsiooni korral on toimunud ühenukleotiidne asendus (guaniin → adeniin) positsioonis 1691, mille tagajärjel esineb viivitus antud hüübimisfaktori inaktivatsioonis. Faktor V Leideni mutatsiooni olemasolu korral suureneb oht trombide tekkeks heterosügootidel kuni 8 korda ning homosügootidel kuni 90 korda (Gene Link … i.a).  

4.1.4 MEETODI PÕHIMÕTE

PCR ehk polümeraasi ahelreaktsioon põhineb DNA-polümeraasi võimel sünteesida uus komplementaarne ahel etteantud matriitsahelale. Reaktsiooni käigus suureneb sünteesitavate märklaudjärjestusega ahelate arvukus eksponentsiaalselt (Polymerase Chain … i.a).  

RFLP ehk restriktsioonifragmentide pikkuste polümorfism on homoloogilise DNA järjestuste analüüsi meetod, kus erinevused DNA primaarjärjestuses tuvastatakse restriktsiooni ensüümide erineva lõike mustriga. Sõltuvalt geenivariandist tekivad analüüsi käigus erineva pikkusega DNA fragmendid (Restriction Fragment … i.a).  

4.1.5 PROOVIMATERJAL JA SELLE SÄILITAMINE

Eelnevalt puhastatud inimpäritoluga DNA, mille kontsentratsioon ja kvaliteet on eelnevalt määratud. Puhastatud DNA säilib –20 oC juures mitmeid kuid.  

4.1.6 UURINGU TEOSTAMISEKS VAJALIK APARATUUR JA TÖÖVAHENDID

  1. Isikukaitsevahendid  
  2. Automaatpipetid (0,5…5 µl, 1…10 µl, 20…200 µl) ja pipetiotsikud  
  3. Eppendorf katsutid ( 200 µl)  
  4. Tsentrifuug (vajadusel)  
  5. PCR masin  
  6. Elektroforeesi aparatuur  
  7. Geeli pildistussüsteem  
  8. Kirjutusvahend  

4.1.7 UURINGU TEOSTAMISEKS VAJALIKUD REAGENDID

  1. 10x Taq [NH4SO4] (Fermentas)  
  2. MgCl2 25 mM (Fermentas)  
  3. dNTP 20 mM (Solis BioDyne)  
  4. Praimer 5’-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA-3’ ehk F praimer 20 pmol  
  5. Praimer 5’-CTTGAAGGAAATGCCCCATTA-3’ ehk R praimer 20 pmol  
  6. MilliQ vesi  
  7. Taq DNA polümeraas (Solis BioDyne)  
  8. DNA suurusmarker 100 bp DNA Ladder (Solis BioDyne)  
  9. 6X DNA Loading Dye Buffer Orange and Blue (Solis BioDyne)  
  10. Restriktsioonipuhver FastDigest Green Buffer (Thermo Scientific)  
  11. FastDigest ensüüm MnlI (Thermo Scientific)  
  12. DNA suurusmarker GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder (Thermo Scientific) 13. 6X DNA Loadnig Dye (Solis BioDyne)  

4.1.8 TÖÖOHUTUS JA JÄÄTMEKÄITLUS

Kasutatavat uuringumaterjali ja reagente tuleb käsitseda kui potentsiaalselt nakkusohtlikku materjali.  

Kõik potentsiaalselt nakkusohtliku bioloogilise materjaliga saastunud jäätmed kogutakse vastavasse jäätmenõusse.  

4.1.9 TÖÖKÄIK

4.1.9.1 Ettevalmistused analüüsiks

  1. Enne analüüsi teostamist tõsta reaktiivid ja proovimaterjal sügavkülmast termokarpi, hoia jääl  
  2. Markeeri katsutid (200 µl Eppendorf)  

4.1.9.2 PCR  

PCR segu valmista 200 µl Eppendorf katsutisse. Selleks pipeteeri  

  1. 33,5 µl MilliQ vesi  
  2. 5 µl 10x Taq [NH4SO4] puhver   
  3. 3 µl 25 mM MgCl2  
  4. 0,5 µl 20 mM dNTP  
  5. 1 µl 20 pmol F praimer  
  6. 1 µl 20 pmol R praimer  
  7. 5 µl DNA  
  8. 1 µl Taq polümeraas

Aseta katsut PCR masinasse, vali PCR programm leiden5, sisesta reaktsioonisegu ruumala (50 µl) ning käivita PCR programm.  

PCR programm:

  1. 94,0 oC 2 min  
  2. 94,0 oC 20 sek  
  3. 53,0 oC 20 sek  
  4. 72,0 oC 20 sek  
  5. Korda 2.–4. 31 korda  
  6. 72,0 oC 2 min  
  7. 16,0 oC ∞   

4.1.9.3 Agaroosgeelelektroforees  

Peale PCR programmi lõppemist kontrolli reaktsiooni tulemust 1,5% agaroosgeelil. Esimesse geeli süvendisse pipeteeri 2 µl 100 bp DNA Ladder, järgmisesse süvendisse 10 µl PCR produkti, mis on eelnevalt värvitud 6X DNA Loading Dye Buffer Orange and Blue’ga. Geelelektroforees vii läbi 60 V juures 15…20 minutit. Peale geelelektroforeesi läbiviimist visualiseeri PCR produktid geeli pildistussüsteemi abil. PCR reaktsiooni õnnestunud toimumise korral on näha fragment 220 bp juures.  

4.1.9.4 Restriktsiooniensüümiga lõikamine  

Restriktsioonisegu valmista 200 µl Eppendorf katsutisse. Selleks pipeteeri  

  1. 17 µl MilliQ vesi  
  2. 10 µl PCR produkt  
  3. 2 µl 10X FastDigest Green Buffer  
  4. 1 µl FastDigest MnlI  

Aseta katsut PCR masinasse ja vali programm 37. Lase ensüümil toimida 37 °C juures 40 minutit.  

4.1.9.5 Polüakrüülamiidgeelelektroforees

Geelelektroforees vii läbi 10% polüakrüülamiidgeeliga. Polüakrüülamiidgeeliga töötamisel kanna alati kummikindaid! Pipeteeri geeli ühte süvenditesse 2 µl suurusmarkerit. Selleks valmista eelnevalt 6 µl suurusmarkeri lahust.  

  1. 4 µl MilliQ vesi  
  2. 1 µl 6X DNA Loading Dye  
  3. 1 µl GeneRuler Ultra Low DNA Ladder  

Valmistatud lahust hoia jääl kuni kasutamiseni. Järgmisesse süvendisse pipeteeri 6 µl lõigatud PCR produkti. Geelelektroforees vii läbi 140 V juures 2 tundi. Peale geelelekroforeesi läbiviimist visualiseeri PCR lõigatud produktid geeli pildistussüsteemi abil.  

4.1.9.6 Tulemuste interpreteerimine  

Peale produktide visualiseerimist UV-kiirguse abil on agaroosgeelis näha DNA fragmendid. Mutatsioonita variandi puhul tekivad fragmendid, mis koosnevad 116, 67 ja 37 aluspaarist, heterosügootidel 153, 116, 67 ja 37 aluspaarist ja mutatsiooniga homosügootidel 67 ja 153 aluspaarist.  

Polüakrüülamiidgeelektroforeesi Ultra Low Range DNA Ladder’i ja DNA fragmentide skemaatiline joonis.  
Joonis 1. Polüakrüülamiidgeelektroforeesi Ultra Low Range DNA Ladder’i ja DNA fragmentide skemaatiline joonis.  

4.1.10 ALLIKALOEND 

Detection of Factor V Leiden (R506Q) Mutation by PCR-RFLP. (i.a). http://slideplayer.com/slide/5987380/ (07.11.2016)

Gene Link manuaal. (i.a). https://www.genelink.com/Literature/ps/M40-2035-10_Ver3.1.pdf (20.09.2016)  

Karus, A. (2015). Metoodiliste juhendite koostamine – ABO ja RH(D) määramiseks ning erütrotsütaarsete antikehade sõeluuringuks. Tartu Tervishoiu Kõrgkool, bioanalüütiku õppekava. Tartu. Lõputöö.  

Pernod, G., Mossuz, P., Polack, B. (1997). Optimized Factor V Gene Mutation Detection Using Buffy-Coat Direct PCR. BioTechniques, 22: 837–841.  

Polymerase Chain Reaction (PCR). (i.a). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/ (05.05.2016)

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). (i.a). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/ (05.05.2016)

Sissejuhatus Järgmine peatükk

Sisukord

← Sisukord