| Tartu Tervishoiu Kõrgkool Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat | ||
| Koostas: | Helen Roosiväli | Kuupäev 12.01.2020 |
| Kinnitas: | Mare Remm | Kuupäev 12.01.2020 |
3.6.1 MEETODI ULATUS
In Vitro: altsiaansinine-perjoodhape-Schiff (PAS)-hematoksüliin värving on mõeldud süsivesikute esile toomiseks eelkõige peen- ja jämesoolest, värvides happelised mutsiinid siniseks, neutraalsed mutsiinid lillakas-roosaks ning happeliste ja neutraalsete mutsiinide kombineeritud alad sinakas-lillaks; rakutuumad värvuvad tumesiniseks.
3.6.2 MEETODI KEHTIVUS
Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH
Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH
Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI
3.6.3 EESMÄRK
Käesolev juhend on mõeldud peen- ja jämesoole epiteelide värvimiseks ja kasutamiseks Tartu Tervishoiu Kõrgkooli patoloogia õppelaboris altsiaansinine-perjoodhape-Schiff-hematoksüliin värvimismeetodil.
Altsiaansinise-perjoodhappe-Schiff (Periodic Acid Schiff, PAS)-hematoksüliini, edaspidi nimetatud kui altsiaansinise-PAS-hematoksüliini, erivärvingul värvuvad peen- ja jämesoole epiteelis olevad happelised mutsiinid siniseks, neutraalsed mutsiinid lillakas-roosaks ja happeliste ning neutraalsete mutsiinide kombineeritud alad sinakas-lillaks.
Juhendi läbitöötamise järgselt tudeng:
- kasutab vajalikke töövahendeid;
- valmistab vajaminevaid lahuseid;
- tagab ning mõtestab lahti enda, kaastöötajate ja keskkonna ohutuse erivärvingu teostamisel;
- teostab histoloogilisele preparaadile altsiaansinise-PAS-hematoksüliini värvingu;
- hindab valminud preparaadi värvingu kvaliteeti.
3.6.4 TEGEVUSJUHIS
3.6.4.1 Proovimaterjali ettevalmistus
Pärast koetüki väljalõikamist materjal töödeldakse koeprotsessoris: fikseeritakse 10% puhverdatud formaliiniga, seejärel vabastatakse fiksaatorist ja veetustatakse. Fiksaatorist vabastamine ja veetustamine on vajalikud järgnevate ainete tungimiseks koetükki. Parafiinsisestus toimub vastavalt üldistele nõuetele. Värvingu jaoks on vajalikud õhukesed koelõigud paksusega 2 µm. Lõigud sirutatakse vesivannil, püütakse alusklaasile ja hoitakse kinnitumiseks vähemalt 40 min soojal laual või termostaadis (56 °C juures).
3.6.4.2 Töövahendid
- 100 ml Erlenmeyer’i kolvid (7 tk);
- 25 ml Erlenmeyer’i kolb (1 tk);
- 100 ml mõõtesilindrid (2 tk);
- 5 ml klaasist pipetid (3 tk);
- kummipirn;
- spaatlid (3 tk);
- klaaspulgad (6 tk);
- lehter;
- filterpaber;
- taimer;
- kleepsud anumate märgistamiseks;
- 100 ml vannid deparafineerimiseks, värvimiseks ja dehüdreerimiseks (20 tk);
- tõmbekapp;
- kaal.
3.6.4.3 Ohutusnõuded ja jäätmekäitlus
Kogu tööprotsessi jooksul kanda kindaid ning laborikitlit. Vältida kemikaalide sattumist nahale ja limaskestadele (tabel 1). Töötada tõmbekapi all, vältida kemikaali aurude sissehingamist. Kasutatud värvilahused ja reagendid koguda vastava märgistusega jäätmenõudesse, millel on vastava kemikaali nimetus. Lahuseid ei tohi valada kanalisatsiooni, need saadetakse hiljem jäätmekäitlusesse.
| Jää-äädikhape (kontsentreeritud etaanhape), CH3COOH |   |
| Altsiaansinine, C56H68Cl4CuN16S4 |  |
| Perjoodhape, H5IO6 |  |
| Schiff reagent | |
| Naatrium-metabisulfit, Na2S2O5 | |
| Harris hematoksüliin, | |
| Etanool, C2H6O | |
| Ksüleen, C8H10 | |
Tabel 1. Vajalikud reagendid ja nendega seotud ohud:
3.6.5 TÖÖLAHUSTE VALMISTAMINE
3.6.5.1 Ettevalmistus
Võtta 7 Erlenmeyer’i koonilist kolbi, märgistada need kleepsude abil valmistatavate lahuste nimetustega. Nimetused kleepida ka värvivannidele. Valmista lahused järgnevalt.
3.6.5.2. Äädikhappe 3% lahus, 2 tk
Vajalikud ained: jää-äädikhape (kontsentreeritud etaanhape), destilleeritud vesi.
Mõõta kahte 100 ml Erlenmeyer’i kolbidesse mõõtesilindriga 97 ml destilleeritud vett ning lisada klaaspipetiga 3 ml jää-äädikhapet. Segada klaaspulgaga.
3.6.5.3 Altsiaansinise lahus
Vajalikud ained: altsiaansinine, 3% äädikhappe lahus.
Kaaluda 100 ml Erlenmeyer’i kolbi 1 g altsiaansinist ning lahustada see ühes eelnevalt valmistatud 3% äädikhappe lahuses. Segada klaaspulgaga. Enne kasutamist filtreerida.
3.6.5.4 Perjoodhappe 0,5% lahus
Vajalikud ained: perjoodhape, destilleeritud vesi
Kaaluda 100 ml Erlenmeyer’i kolbi 0,5 g perjoodhapet ning lahustada see mõõtesilindriga mõõdetud 100 ml destilleeritud vees. Segada klaaspulgaga.
3.6.5.5 Schiff reagent
Valmiskujul olev kommertsiaalne lahus, valada otse klaasvanni.
3.6.5.6 Kontsentreeritud naatrium-metabisulfitit sisaldav loputuslahus
Vajalikud ained: naatrium-metabisulfit, destilleeritud vesi.
Kaaluda 25 ml Erlenmeyer’i kolbi 1 g naatrium-metabisulfitit ning lahustada see mõõtesilindriga mõõdetud 10 ml destilleeritud vees. Segada klaaspulgaga. Kasutamiseks tuleb seda lahust lahjendada.
3.6.5.7 Lahjendatud naatrium-metabisulfitit sisaldav loputuslahus
Vajalikud ained: eelnevalt valmistatud kontsentreeritud loputuslahus, destilleeritud vesi.
Mõõta 100 ml Erlenmeyer’i kolbi klaaspipetiga 5 ml kontsentreeritud loputuslahust ning lisada mõõtesilindriga mõõdetud 95 ml destilleeritud vett. Segada klaaspulgaga. Valmistada vahetult enne värvimist.
3.6.5.8 Harris hematoksüliini-äädikhappe lahus
Vajalikud ained: Harris hematoksüliin, jää-äädikhape (kontsentreeritud etaanhape).
Mõõta 100 ml Erlenmeyer’i kolbi mõõtesilindriga 96 ml Harris hematoksüliini ning lisada klaaspipetiga 4 ml jää-äädikhapet. Segada klaaspulgaga.
3.6.6 VÄRVIMISE KÄIK
3.6.6.1 Värvivannide ettevalmistus
Märgistada ja valada vannidesse: parafiini lahustamise rida, vette viimise rida, töölahused: äädikhappe 35% lahus, altsioonsinise lahus, perjoodhappe 0,5% lahus, Schiff reagent, naatrium-metabisulfitit sisaldav loputuslahus, Harris hematoksüliin-äädikhappe lahus, ja loputamisnõud nii kraaniveele kui ka destilleeritud veele, lõpliku veetustamise ja selgitamise rida ning katmisvahendid.
3.6.6.2 Värvimine
Viia läbi värvimine vastavalt all olevale skeemile:
- lahustada parafiin: ksüleen (5min) → ksüleen (5min) → ksüleen (5min);
- teostada vette viimine: 95% etanool (3 min) → 95% etanool (3 min) → 50% etanool (3 min) (50% etanooli saamiseks mõõta 52ml 95% etanooli ja 48 ml destilleeritud vett) → 2 × destilleeritud vesi (5 min);
- hoida preparaati 3% äädikhappe lahuses 1 min;
- hoida preparaati altsiaansinise lahuses 20 min;
- viia preparaat kraaniveega täidetud vanni ja hoida jooksva kraanivee all 5 s või kuni värvi enam ei eraldu;
- loputada preparaati destilleeritud vees 2‒3 s;
- hoida preparaati perjoodhappe 0,5% lahuses 10 min;
- viia preparaat kraaniveega täidetud vanni ja hoida jooksva kraanivee all 5 min;
- loputada preparaati destilleeritud vees 2‒3 s;
- hoida preparaati Schiff reagendis 10 min;
- hoida lahjendatud naatrium-metabisulfitit sisaldavas loputuslahuses 5 min;
- viia preparaat kraaniveega täidetud vanni ja hoida jooksva kraanivee all 10 min;
- hoida preparaati Harris hematoksüliin-äädikhappe lahuses 45 s;
- viia preparaat kraaniveega täidetud vanni ja hoida jooksva kraanivee all 5 s või kuni värvi enam vette ei eraldu;
- veetustada: 95% etanool (3 s) → 95% etanool (3 s) → isopropanool (3 s);
- selgitada: ksüleen (3 s) → ksüleen (3 s) → ksüleen (5 min);
- kuivatada preparaat altpoolt ja külgedelt;
- kanda preparaadile kattepalsam ning katta sobiva suurusega katteklaasiga. Eemaldada vajadusel mullid ja puhastada preparaat. Etikettida.
3.6.7 TULEMUS
Happelised mutsiinid — sinised
Neutraalsed mutsiinid — lillakas-roosad
Happeliste ja neutraalsete mutsiinide kombineeritud alad — sinakas-lillad
Tuumad — tumesinised
