| Tartu Tervishoiu Kõrgkool Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat | ||
| Koostas: | Olga Mamošina | Kuupäev 08. 01. 2018 |
| Kinnitas: | Mare Remm | Kuupäev 08. 01. 2018 |
In Vitro: Gomori hõbetamis meetodiga värvitakse retikuliinkiud mustaks, rakutuumad hallikas-purpurseks ning kollageen purpurseks
3.5.1 MEETODI KEHTIVUS
Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH
Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH
Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI
3.5.2 EESMÄRK
Käesolev juhend on mõeldud retikuliinkiudude värvimiseks ning kasutamiseks Tartu Tervishoiu Kõrgkooli patoloogia õppelaboris. Lisaks maksale saab Gomori hõbetamismeetodi abil värvida neeru ja põrna, mis samuti sisaldavad retikuliinkiude.
Pärast juhendi läbitegemist oskab tudeng:
- tagada enda, kaastöötjate ja keskkonna ohutuse tööprotsessis;
- kasutada patoloogia labori töövahendeid ja valdab erialast terminoloogiat;
- valmistada vajalikke lahuseid;
- teostada histoloogilise preparaadi valmistamise etappe ja mõistab nende põhimõtet;
- järgida juhist ja teostab värvingu edukalt;
- hinnata saadud preparaadi kvaliteeti.
3.5.3 TEGEVUSJUHIS
3.5.3.1 Proovimaterjali ettevalmistus
Pärast koetüki väljalõikamist materjal töödeldakse koeprotsessoris: fikseeritakse 10% puhverdatud formaliiniga, seejärel vabastatakse fiksaatorist ja veetustatakse. Fiksaatorist vabastamine ja veetustamine on vajalikud järgnevate ainete tungimiseks koetükki. Parafiinsisestus toimub vastavalt üldistele nõuetele. Värvingu jaoks on vajalikud õhukesed koelõigud paksusega 1–3 µm. Lõigud sirutatakse vesivannil, püütakse alusklaasile ja hoitakse kinnitumiseks vähemalt 40 min soojal laual või termostaadis (56 °C juures).
3.5.3.2 Töövahendid
Lahuste valmistamiseks: 50 ml, 100 ml Erlenmeyer’i kolvid, kaal, automaatpipett, Pasteur’i pipetid, klaaspulgad. Värvimiseks: klaasanumad, taimer, kleepsud anumate märgistamiseks, kirjutusvahend.
3.5.3.3 Ohutusnõuded ja jäätmekäitlus
Kogu tööprotsessi jooksul kanda kindaid ning laborikitlit. Vältida kemikaalide sattumist nahale ja limaskestadele (tabel 1). Töötada tõmbekapi all, vältida kemikaali aurude sissehingamist. Kasutatud värvilahused ja reagendid koguda vastava märgistusega jäätmenõudesse, millel on vastava kemikaali nimetus. Lahuseid ei tohi valada kanalisatsiooni, need saadetakse hiljem jäätmekäitlusesse.
| Hõbenitraat, AgNO3 |    |
| Kaaliumhüdroksiid, KOH |  |
| Ammoniumhüdroksiid, NH4OH | |
| Oksaalhape, H2C2O4 × 2H2O | |
| Ammooniumraud(II)sulfaat, (NH4)2Fe(SO4)2 × 6H2O | |
| Kaaliumpermanganaat, KMnO4 | |
| Kuldkloriid, AuCl3 | |
| Naatriumtiosulfaat, Na2S2O3 | |
| Neutraalpunase lahus | |
Tabel 1. Vajalikud reagendid ja nendega seotud ohud
3.5.4 TÖÖLAHUSTE VALMISTAMINE
3.5.4.1 Ettevalmistus
Võtta 6 Erlenmeyer’i koonilist kolbi ning märgistada need kleepsude abil valmistatavate lahuste nimetustega. Nimetused kleepida ka värvivannidele. Valmista lahused järgnevalt.
3.5.4.2 Diamiinhõbe(I)nitraat
Vajalikud ained: 10% hõbenitraat (AgNO3), 10% kaaliumhüdroksiid (KOH), ammooniumhüdroksiid (NH4OH), destilleeritud vesi.
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 5g hõbenitraati ja lisada 45 ml destilleeritud vett.
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 5g kaaliumhüdroksiidi ja lisada 45 ml destilleeritud vett.
Valada 10 ml 10% hõbenitraadi ja 2,5 ml 10% kaaliumhüdroksiidi lahust kokku 100 ml suurusesse Erlenmeyer’i kolbi. Tekib sade. Supernatant eemaldada Pasteur’i pipetiga. Sadet loputatakse destilleeritud veega kaks korda. mõlemal korral eemaldatakse vesi Pasteur’i pipetiga. Pärast loputamist lisada 10 ml destilleeritud vett. Kergelt segades lisada tilkadena ammooniumhüdroksiidi kuni sademe lahustumiseni. Seejärel tilgutada aeglaselt 10% hõbenitraadi lahust kuni värv muutub piimjas läbipaistvaks. Lõpuks lisada 20 ml destilleeritud vett.
3.5.4.3 Oksaalhappe 1% lahus
Vajalikud ained: oksaalhape (H2C2O4 × 2H2O), destilleeritud vesi.
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 0,6 g oksaalhapet ja lisada 49,4 ml destilleeritud vett.
3.5.4.4 Ammooniumraud(II)sulfaat kuus vesi 2,5% lahus
Vajalikud ained: ammooniumraud(II)sulfaat kuus vesi (NH4)2Fe(SO4)2× 6H2O), destilleeritud vesi.
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 1,73 g (NH4)2Fe(SO4)2× 6H2O* ja lisada 48,27 ml vett.
*Koguste arvutamine oleneb ammooniumraud(II)sulfaadi veesisaldusest. Kui kasutate teistsuguse ainevalemiga ammoonium(II)sulfaati, teha vastavad arvutused enne kaalumist.
3.5.4.5 Kaaliumpermanganaadi 1 % lahus
Vajalikud ained: kaaliumpermanganaat (KMnO4), destilleeritud vesi.
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 0,5 g kaaliumpermanganaati ja lisada 49,5 ml destilleeritud vett.
3.5.4.6 Kuldkloriidi 0,2% lahus
Vajalikud ained: kuldkloriid (AuCl3), destilleeritud vesi.
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 0,1 g kuldkloriidi ja lisada 50 ml destilleeritud vett.
3.5.4.7 Naatriumtiosulfaadi 5% lahus
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 2,5 g naatriumtiosulfaati ja lisada 47,5 ml destilleeritud vett.
3.5.4.8 Neutraalpunase lahus
Kasutage kõrgkooli bioanalüütiku poolt valmistatud lahust.
3.5.5 VÄRVIMISE KÄIK
3.5.5.1 Värvivannide ettevalmistus
Märgistada ja valada vannidesse: parafiini lahustamise rida, vette viimise rida, töölahused: diamiinhõbe (I)nitraadi lahus, oksaalhappe lahus, ammooniumraud(II)sulfaat kuus vesi lahus, kaaliumpermanganaadi lahus, kuldkloriidilahus, naatriumtiosulfaadi lahus, neutraalpunase lahus ja loputamisnõud, lõpliku veetustamise ja selgitamise rida ning katmisvahendid.
3.5.5.2 Värvimine
Viia läbi värvimine vastavalt all olevale skeemile:
- ahustada parafiin: ksüleen (5min) → ksüleen (5min) ksüleen (5min);
- teostada vette viimine: 95% etanool (3 min) → 95% etanool (3 min) → 60% etanool (3 min) → kraanivesi (3 min);
- töödelda 1% kaaliumpermanganaadi vesilahusega 2 min;
- loputada kraanivee all 2 min;
- pleegitada 1% oksaalhappe vesilahuses 2 min;
- põhjalikult loputada kraanivee all;
- töödelda 2,5% ammooniumraud(II)sulfaat lahusega 1 min;
- loputada kraanivee all 2 min ja seejärel loputada põhjalikult destilleeritud vees;
- immutada lõigud diamiinhõbe(I)nitraadiga 3 min;
- põhjalikult loputada destilleeritud vees;
- töödelda (redutseerida) 10% formaliini lahusega 3 min;
- loputada 2 min kraanivee all ja destilleeritud vees;
- toonida 0,2% kuldkloriidi lahusega 10 min;
- põhjalikult loputada destilleeritud vees;
- töödelda 5% naatriumtiosulfaadi lahusega 5 min;
- põhjalikult loputada kraanivee all;
- kontrastvärving neutraalpunasega 1 min;
- hoida jooksva kraanivee all 1 min;
- veetustada: 95% etanool (3 s) → 95% etanool (3 s) → isopropanool (3 s);
- selgitada: ksüleen (3min) → ksüleen (3min) → ksüleen (2 min või kuni katmiseni);
- kanda preparaadile kattepalsam ning katta sobiva suurusega katteklaasiga. Eemaldada vajadusel mullid ja puhastada preparaat. Etikettida.
3.5.6 TULEMUSED
Retikuliinkiud — mustad
Tuumad — hall‒purpur
Kollageen — purpur
