| Tartu Tervishoiu Kõrgkool Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat | ||
| Koostas: | Eret Luik | Kuupäev 10.01.2017 |
| Kinnitas: | Mare Remm | Kuupäev 25.01.2017 |
3.3.1 MEETODI ULATUS
In Vitro: Verhoeff van Gieson’i värving võimaldab üheaegselt värvida nii elastseid kiudusid kui ka kollageenseid kiudusid kudedes.
3.3.2 MEETODI KEHTIVUS
Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH
Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH
Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI
3.3.3 EESMÄRK
Käesolev juhend on mõeldud preparaatide värvimiseks Verhoeff meetodil Tartu Tervishoiu Kõrgkooli patoloogia õppelaboris. Värving on mõeldud elastsete kiudude eristamiseks, värvides elastsed kiud mustaks ning vastandvärvimisel van Gieson’iga kollageeni punaseks.
Pärast juhendi läbitegemist oskab tudeng:
- tagada enda, kaastöötjate ja keskkonna ohutuse tööprotsessis;
- kasutada patoloogia labori töövahendeid ja valdab erialast terminoloogiat;
- valmistada vajalikke lahuseid;
- teostada histoloogilise preparaadi valmistamise etappe ja mõistab nende põhimõtet;
- järgida juhendit ja teostada värving edukalt;
- hinnata saadud preparaadi kvaliteeti.
3.3.4 TEGEVUSJUHIS
3.3.4.1 Proovimaterjali ettevalmistus
Pärast koetüki väljalõikamist materjal töödeldakse koeprotsessoris: fikseeritakse 10% puhverdatud formaliiniga, seejärel vabastatakse fiksaatorist ja veetustatakse. Fiksaatorist vabastamine ja veetustamine on vajalikud järgnevate ainete tungimiseks koetükki. Parafiinsisestus toimub vastavalt üldistele nõuetele. Värvingu jaoks on vajalikud õhukesed koelõigud paksusega 3‒5 µm. Lõigud sirutatakse vesivannil, püütakse alusklaasile ja hoitakse kinnitumiseks vähemalt 40 min soojal laual või termostaadis (56 °C juures).
3.3.4.2 Töövahendid
Erlenmeyer’i (koonilised) kolvid, kaal, elektripliit, klaaspulgad, mõõtesilinder, väiksemad värvivannid, kindad, kittel, taimer, spaatlid, kleepsud, marker.
3.3.4.3 Ohutusnõuded ja jäätmekäitlus
Kogu tööprotsessi jooksul kanda kindaid ning laborikitlit. Vältida kemikaalide sattumist nahale ja limaskestadele. Töötada tõmbekapi all, vältida kemikaali aurude sissehingamist. Kasutatud värvilahused ja reagendid koguda vastava märgistusega jäätmenõudesse, millel on vastava kemikaali nimetus. Lahuseid ei tohi valada kanalisatsiooni, need saadetakse hiljem jäätmekäitlusesse.
3.3.5 TÖÖLAHUSTE VALMISTAMINE
3.3.5.1 Ettevalmistus
Võtta 6 Erlenmeyer’i koonilist kolbi ning märgistada need kleepsude abil valmistatavate lahuste nimetustega. Nimetused kleepida ka värvivannidele. Valmista lahused järgnevalt.
3.3.5.2 Hematoksüliini lahus 50 ml
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 2,5 g hematoksüliini. Mõõta mõõtesilindriga 50 ml isopropanooli ning valada see samasse kolbi. Lahustada hematoksüliin kergelt kuumutades ja klaaspulgaga segades.
3.3.5.3 Raudkloriidi 10% lahus 25ml
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 4,2 g kristallveega raudkloriidi (FeCl3×6H2O) *. Mõõta mõõtesilindriga 21 ml destilleeritud vett ning valada samasse kolbi. Lahustada segades.
*Koguste arvutamine oleneb raudkloriidi veesisaldusest. Kui kasutate teistsuguse ainevalemiga raudkloriidi, teha vastavad arvutused enne kaalumist.
3.3.5.4 Joodi lahus 25 ml (Lygol’i lahus)
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 0,5 g joodi, vajutada kaalul „tare“ ehk viia näit nulli ning mõõta samasse kolbi 1 g kaaliumjodiidi. Mõõta mõõtesilindriga 25 ml destilleeritud vett ning valada samasse kolbi. Lahustada segades.
Eespool nimetatud kolm lahust moodustavad kokku valamisel Verhoeff’i töölahuse, sellest kokku valamisest vt allpool.
3.3.5.5 Raudkloriidi 2% lahus 100 ml
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 3,3 g* kristallveega raudkloriidi (FeCl3×6H2O). Mõõta mõõtesilindriga 97 ml destilleeritud vett ning valada samasse kolbi. Lahustada segades.
*Koguste arvutamine oleneb raudkloriidi veesisaldusest. Kui kasutate teistsuguse ainevalemiga raudkloriidi, teha vastavad arvutused enne kaalumist.
3.3.5.6 Naatriumtiosulfaadi lahus 100 ml
Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 5 g naatriumtiosulfaati (Na2S2O3). Mõõta mõõtesilindriga 100 ml destilleeritud vett ning valada samasse kolbi. Lahustada segades.
3.3.5.7 Verhoeff töölahus 100ml
Valmistada vahetult enne värvimist! Valada väikesesse värvivanni 50 ml hematoksüliini lahust (ei pea olema jahtunud), 25 ml raudkloriidi 10% lahust ning 25 ml joodi lahust. *Kui lahuste kokku valamisel tekib sade, siis tuleb lahust enne kasutamist filtreerida.
3.3.5.8 Van Gieson’i lahus
Kõrgkooli laboris kasutatakse ostetud valmis lahust, mida valatakse pudelist otse värvivanni. Juhul kui lahusel on sees sade, tuleb lahus enne kasutamist läbi filtreerida.
3.3.6 VÄRVIMISE KÄIK
3.3.6.1 Värvivannide ettevalmistus
Märgistada ja valada vannidesse: parafiini lahustamise rida, vette viimise rida, töölahused: Verhoeff’i töölahus (sildistada vann, kuid töölahus valada kokku alles vahetult enne kasutamist), raudkloriidi 2% lahus, naatriumtiosulfaadi lahus, van Gieson’i värvilahus ja loputamisnõud (kraanivesi!), lõpliku veetustamise ja selgitamise rida ning katmisvahendid.
3.3.6.2 Värvimine
Viia läbi värvimine vastavalt all olevale skeemile.
- Lahustada parafiin: 1. ksüleen (5min) à 2. ksüleen (5min) à 3. ksüleen (5min).
- Teostada vette viimine: 95% etanool (3min) à 95% etanool (3min) à70% etanool* (3min) à destilleeritud vesi (3min).
*70% etanooli valmistamiseks mõõta mõõtekolbiga 72 ml 95% etanooli ning 28 ml destilleeritud vett.
- Hoida preparaati Verhoeff töölahuses 12 minutit.
- Loputada preparaati mitmes kraaniveega nõus, kuni vesi on puhas.
- Kasta preparaat raudkloriidi 2% lahusesse, seejärel loputada leiges kraanivees ja kontrollida mikroskoobis värvumust — taust peab olema helehall ning elastsed kiud ja tuumad mustad. Vajadusel korrata diferentseerimist ja loputada uuesti leiges kraanivees.
- Hoida preparaati naatriumtiosulfaadi lahuses 1 minut.
- Loputada leiges kraanivees 5 minutit.
- Hoida preparaati van Gieson’i värvilahuses 1 minut.
- Pesta destilleeritud veega.
- Veetustada: 95% etanool (3s) à 95% etanool (3s) à isopropanool (3s).
- Selgitada: ksüleen (3 min) à ksüleen (3 min) à ksüleen (2 min või kuni katmiseni).
- Kanda preparaadile palsamit ning katta sobiva suurusega katteklaasiga. Ajada välja mullid ja puhastada preparaat. Etikettida.
3.3.7 TULEMUS
Elastsed kiud ja tuumad — mustad
Kollageen — roosa kuni punane
Taust — kollane
