3.2 VAN GIESON’I VÄRVINGUMEETODI JUHEND  

Tartu Tervishoiu Kõrgkool  Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat
Koostas:	Hannaliis Leping	Kuupäev 01.12.2015
Kinnitas:	Mare Remm	Kuupäev 01.12.2015

3.2.1. MEETODI ULATUS 

In Vitro: van Gieson’i värvingu läbiviimine, võimaldab kollageensete kiudude tuvastamist kudedest. 

3.2.2. MEETODI KEHTIVUS 

Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH 

Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH 

Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI 

3.2.3. EESMÄRK 

Käesolev juhend on mõeldud kasutamiseks Tartu Tervishoiu Kõrgkoolis patoloogia õppelaboris van Gieson’i histoloogilise värvingumeetodi teostamisel. Van Gieson’i värving on mõeldud sidekoele, eristamaks kollageenseid kiude ülejäänud koest.  

Pärast juhendi läbitegemist oskab tudeng: 

• tagada enda, kaastöötjate ja keskkonna ohutuse tööprotsessis;  
• kasutada patoloogia labori töövahendeid ja valdab erialast terminoloogiat; 
• valmistada vajalikke lahuseid; 
• teostada histoloogilise preparaadi valmistamise etappe ja mõistab nende põhimõtet;  
• järgida juhendit ja teostada värving edukalt; 
• hinnata saadud preparaadi kvaliteeti. 

3.2.4. TEGEVUSJUHIS 

3.2.4.1. Proovimaterjali ettevalmistamine 

Pärast koetüki väljalõikamist materjal töödeldakse koeprotsessoris: fikseeritakse 10% puhverdatud formaliiniga, seejärel vabastatakse fiksaatorist ja veetustatakse. Fiksaatorist vabastamine ja veetustamine on vajalikud järgnevate ainete tungimiseks koetükki. Parafiinsisestus toimub vastavalt üldistele nõuetele. Värvingu jaoks on vajalikud õhukesed koelõigud paksusega 2‒4 µm. Lõigud sirutatakse vesivannil, püütakse alusklaasile ja hoitakse kinnitumiseks vähemalt 40 min soojal laual või termostaadis (56 °C juures). 

3.2.4.2. Vajalikud töövahendid 

Klaasanumad värvimiseks, Erlenmeyer’i kolvid, isikukaitsevahendid – kittel, nitriilkindad, mõõtesilinder, klaaspulgad, klaasist pipett, kummipirn, taimer, tõmbekapp, kaal. Lisaks, juhul kui mõni värvilahustest (ka teistest lahustest) sisaldab sadet, tuleks sade eemaldada filtreerimise abil. Sel juhul on vajalikud ka lehter ja filterpaber.

Lisaks van Gieson’i värvi valmistamise korral: kuumakindad, elektripliit, lehter, filterpaber. 

3.2.4.3. Ohutusnõuded ja jäätmekäitlus

• Tööprotsessi käigus on kohustus kanda isikukaitsevahendeid – kittel, nitriilkindad. 
• Pikriinhape on plahvatusohtlik – mitte käidelda kuivana, peab alati olema seotud veega. 
• Vältida kemikaalide sattumist nahale ja limaskestadele – värvained on toksilised. 
• Van Gieson’i värvilahust tohib keeta ainult tõmbekapi all – keemisel tekkivad aurud on eriti toksilised ja võivad põhjustada hingamisteede ärritust. Kuivõrd koolis kasutatakse valmis kujul ostetud van Gieson’i lahust, siis seda enam ei keedeta 
• Kõik kasutatud lahused tuleb koguda kokku eraldi anumatesse, millele on kleebitud vastava aine nimi ja saata jäätmekäitlusesse – värvilahuseid ja ka teisi lahuseid ei tohi kallata kanalisatsiooni.  
• Jälgida tuleb värvainete tootjapoolset ohutuskaarti.

3.2.5. TÖÖLAHUSTITE VALMISTAMINE

3.2.5.1. Ettevalmistus 

Võtta Erlenmeyer’i koonilised kolvid ning märgistada need kleepsude abil valmistatavate lahuste nimetustega. Nimetused kleepida ka värvivannidele. Weigert’i raudhematoksüliini lahuse A ja B lahus valada kokku alles vahetult enne nende kasutamist. Valmistada lahused järgnevalt. 

3.2.5.2. Weigert’i raudhematoksüliin 

Vajalikud ained: hematoksüliin, 95% etanool, 30% raud(III)kloriidi (FeCl₃) vesilahus, kontsentreeritud vesinikkloriidhape (HCl 35%), destilleeritud vesi. 

A lahus – Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 0,5 g hematoksüliini. Lisada 50 ml etanooli. Segada kuni täieliku lahustumiseni. Hematoksüliin lahustub paremini kui lahust veidi soojendada, samaaegselt segades. 

B lahus – Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 2 g raud(III)kloriid ja seejärel lisada 2 ml destilleeritud vett, segada kuni täieliku lahustumiseni. Seejärel lisada 45,5 ml destilleeritud vett. Mõõta klaasist pipetiga 0,5 ml kontsentreeritud HCl ja lisada see FeCl₃ lahusele.  

A ja B lahus valada kokku alles vahetult enne preparaadi panekut Weigert’i raudhematoksüliini. 

3.2.5.3. Van Gieson’i värv 

Kõrgkooli laboris kasutatakse ostetud van Gieson’i lahust, seega valatakse otse pudelist värvivanni lahus ja kasutatakse seda. Ainus tingimus on, et lahuses ei tohi olla sadet, juhul kui esineb sade, tuleb see kasutamise eelselt välja filtreerida. 

3.2.5.3. Diferentseerimislahus (HCl lahus 70% etanoolis) 

Vajalikud ained: kontsentreeritud HCl, etanooli 70% lahus. 

Mõõta 1 ml kontsentreeritud vesinikloriidhapet Erlenmeyer’i kolbi. Lisada 99 ml 70% etanooli*. 

* 70% etanooli valmistamiseks võtta 72ml 95% etanooli ja 28 ml destilleeritud vett. 

3.2.5.4. Sinetamislahus 

Vajalikud ained: naatriumvesinikkarbonaat (NaHCO₃), destilleeritud vesi. 

Kaaluda Erlenmeyer’i kolbi 2 g NaHCO₃, lisada 100 ml destilleeritud vett. 

3.2.6. VÄRVIMISE KÄIK 

3.2.6.1. Värvivannide ettevalmistus 

Märgistada ja valada vannidesse: parafiini lahustamise rida, vette viimise rida, töölahused: Weigert’i töölahus (sildistada vann, kuid töölahus valada kokku alles vahetult enne kasutamist), diferentseerimise lahus, sinetamise lahus, van Gieson’i lahus  ja loputamisnõud, lõpliku veetustamise ja selgitamise rida ning katmisvahendid. 

3.2.6.2. Värvimine 

Viia läbi värvimine vastavalt all olevale skeemile. 

• Lahustada parafiin: 1. ksüleen (5min) → 2. ksüleen (5min) → 3. ksüleen (5min). Teostada vette viimine: 95% etanool (3min) → 95% etanool → 70% etanool (3min) → kraanivesi (3min). 
• Viia lõigud Weigert’i raudhematoksüliini tuumade värvimiseks 15 min.  
• Pesta kraaniveega, kuni suurem osa värvist on eemaldunud.  
• Diferentseerida happe-alkoholi lahusega (diferentseerimislahus) 2 s.  
• Pesta kraaniveega väga korralikult. 
• Sinetada 2% naatriumvesinikkarbonaadi vesilahusega (sinetamislahus) 30 s. 
• Pesta destilleeritud veega väga korralikult. 
• Värvida van Gieson’i värvilahusega 5 min.  
• Pesta destilleeritud veega, kuni suurem osa värvist on eemaldunud. 
• Veetustada: 95% etanool (3 s) → 95% etanool (3 s) → isopropanool (3 s). 
• Selgitada: ksüleen (3 min) → ksüleen (3 min) → ksüleen (2 min või kuni katmiseni). 
• Kanda preparaadile palsamit ning katta sobiva suurusega katteklaasiga. Ajada välja mullid ja puhastada preparaat. Etikettida. 

3.2.7. TULEMUSED