1.8 RAKKUDE LOENDAMINE LOENDUSKAMBRIS 

Tartu Tervishoiu Kõrgkool Bioanalüütika labori kvaliteedikäsiraamat
Koostas:	Anneli Raave-Sepp	Kuupäev:	26.08.2023
Kinnitas:	Anneli Raave-Sepp	Kuupäev:	26.08.2023

1.8.1. MEETODI ULATUS 

• Käesolev juhend on mõeldud kehavedelikes rakkude (erütrotsüütide, leukotsüütide) loendamiseks Tartu Tervishoiu Kõrgkooli hematoloogia õppelaboris.  

1.8.2. MEETODI KEHTIVUS 

• Meetod kehtib kasutamiseks õppetöös: JAH 
• Meetod kehtib kasutamiseks teadusuuringute teostamisel: JAH 
• Meetod kehtib kliiniliseks kasutamiseks patsiendi proovide teostamisel: EI 

1.8.3. MEETODI PÕHIMÕTE 

• Kamber on valmistatud paksust klaasist ning ristivagudega jagatud kolmeks plaadiks (kaks külgmist ja keskmine). Keskmine plaat jaguneb täiendava ristivaoga kaheks võrdseks osaks, kummaski on graveeritud võrgustik. 
• Keskmine plaat asetseb külgmistest 0,1 mm võrra allpool. Kambri sügavus on seega 0,1 mm (1/10 mm). 
• Kambri täitmine: 
  • Enne täitmist tuleb kambrile tihedalt peale hõõruda lihvitud katteklaas. Pealehõõrumisel surutakse mõlema käe pöialdega kergelt katteklaasi servadele kuni vikerkaarevärviliste rõngaste (Newtoni rõngaste) ilmumiseni.  
  • Kamber täidetakse vao kaudu, mis jääb keskmise plaadi ja katteklaasi vahele. Kamber tuleb täita nii, et kogu kamber oleks täidetud ja õhumullikesi sisse ei satuks, sest see rikub vererakkude asetust kambris. Täitmiseks kasutatakse näiteks Pasteuri pipetti vmt. 
  • Täidetud kamber jäetakse 2-3 minutiks seisma, et vormelemendid sadeneksid ja nende liikumine peatuks.  
• Rakkude loendamisel kambris kehtib järgmine reegel: 
  • Kui üle poole rakust asub võrgustiku ruudu sees, loetakse ta kaasa, kui aga suurem osa rakust on väljaspool ruudu piirjoont, teda kaasa ei loeta.  
  • Rakud, mida ruutude vaheline piirjoon täpselt pooleks jagab, loetakse kaasa ruudu kahelt küljelt – ülemiselt ja vasakpoolselt piirjoonelt, teiselt kahelt küljelt – alumiselt ja parempoolselt ei loeta. 
• Vead rakkude loendamisel: 
• Subjektiivsed – neid on võimalik vältida korraliku tööga: 
  • Kasutatakse ebakorrektset (hemolüüsunud, hüübega) proovimaterjali ja loendusel saadakse tegelikust madalamad väärtused. 
  • Kambri mittetäielik täitmine, õhumullikeste sattumine kambrisse. 
  • Kambri mittekorralikul katmisel katteklaasiga võivad Newtoni rõngad jääda moodustamata kas mõlemal pool või ühel pool, sellisel juhul on kambri kõrgus ettenähtust suurem ja järelikult on suurem ka kambri ruumala. 
  • Vormelementide loendamine kohe pärast täitmist, ootamata 2-3 minutit. Kuna mikroskopeerimisel on nähtavad ainult need rakud, mis on sadenenud kambri põhja, saadakse sel juhul õigetest madalamad väärtused. 
• Objektiivsed vead – tingitud meetodist enesest: 
  • Rakkude ebaühtlane jaotus kambris. 
  • Kambri tehniline ebatäiuslikkus. 

1.8.4. GORJAJEVI LOENDUSKAMBER 

• Kambri pindala 9 mm².  
• Võrgustik koosneb 225 suurest ruudust (15 x 15). Suure ruudu serva pikkus on 1/5 mm, pindala 1/25 mm² ja ruumala 1/250 mm³. Osa suurtest ruutudest – iga kolmas – jaguneb 16 väikeseks ruuduks. Väikese ruudu serva pikkus on 1/20 mm, talle vastava kambriosa ruumala 1/4000 mm³ (Joonis 1).  
• Kasutatakse peamiselt erütrotsüütide ja leukotsüütide loendamiseks veres. 

TÖÖKÄIK: 

• ERÜTROTSÜÜTIDE LOENDAMINE GORJAJEVI KAMBRIS 

1. Mõõda katsutisse 4 ml 3% NaCl lahust 
2. Lisa 20 µl kapillaar- või veeniverd (EDTA antikogulandiga) 
3. Sega katsutis olevat lahust veeretades katsutit peopesade vahel 
4. Kata Gorjajevi kamber katteklaasiga  
5. Täida kamber 
6. Lase kambril 2-3 minutit seista 
7. Pane mikroskoop töökorda 
8. Loenda erütrotsüüdid mikroskoobi suure suurendusega (40x objektiiv) kambri 80-s väikeses ruudus (5 diagonaalselt asetsevas suures ruudus, mis on vertikaal- ja horisontaaljoontega omakorda jaotatud 16 väikeseks ruuduks) 
9. Arvuta erütrotsüütide hulk 1 µl-s veres, arvestades vere 200-kordset lahjendust 

Arvutamise näide:

80 väikeses ruudus loendati 400 erütrotsüüti; vere lahjendus oli 200-kordne.  

Erütrotsüütide hulk 1 µl veres on:

Tulemuse saame lihtsamalt, kui 80 väikeses ruudus loendatud erütrotsüütide arv korrutatakse 10 000-ga. 

• LEUKOTSÜÜTIDE LOENDAMINE GORJAJEVI KAMBRIS 

1. Mõõda katsutisse 0,4 ml = 400µl 3% äädikhapet (lõhustab erütrotsüüdid) 

2. Lisa 20 µl kapillaar- või veeniverd (EDTA antikoagulandiga) 

3. Sega katsutis olevat lahust veeretades katsutit peopesade vahel 

4. Kata Gorjajevi kamber katteklaasiga  

5. Täida kamber 

6. Lase kambril 2-3 minutit seista 

7. Pane mikroskoop töökorda 

8. Loenda leukotsüüdid mikroskoobi väikese suurendusega (10x objektiiv) kambri 100-s suures ruudus (kõikides jaotusteta ruutudes). Leukotsüüte loendatakse 100 suures jaotuseta ruudus, mis asetsevad 4-ruuduste rühmadena. Igas reas on  5 sellist rühma (s.o. 20 suurt ruutu). Viies horisontaalreas on 100 suurt ruutu. 100 suurele ruudule vastab 100 x 16 = 1600 väikest ruutu 

9. Arvuta leukotsüütide hulk 1 µl-s veres, arvestades vere 20-kordset lahjendust  

Arvutamise näide:  

100 suures ruudus ehk 1600 väikeses ruudus loendati 100 leukotsüüti, vere lahjendus oli 20-kordne.  

Leukotsüütide hulk 1 µl veres on: 

Tulemuse saame lihtsamalt, kui 100 suures ruudus loendatud leukotsüütide arvu korrutame 50-ga. 

NB! Kui leukotsüütide koguarv on alla 5000, on soovitav teha 10-kordne lahjendus. Sel juhul korrutatakse 100 suures ruudus loendatud leukotsüütide arv 25-ga, et saada Lk hulk 1 µl-s. 

Kui leukotsüütide koguarv on aga väga suur (> 150 000), tehakse 100- või 200-kordne lahjendus. 

1.8.5. FUCHS-ROSENTHAL’I LOENDUSKAMBER 

• Kambri maht on 3,2 µl. 
• Koosneb 16-st suurest ruudust, mis on omakorda jaotatud 16 väikeseks ruuduks (Joonis 2).  
• Kasutatakse rakkude loendamiseks peamiselt uriinis, liikvoris, sünoviaalvedelikus. 

• Uuritava materjali ettevalmistus rakkude lugemiseks: 
  • Vere puhul toimub nagu Gorjajevi kambri korral;  
  • Teiste kehavedelike korral tehakse vajadusel lahjendused füsioloogilise lahusega ja leukotsüütide loendamisel erütrotsüütide purustamine nt äädikhappega (v.a. liigesvedeliku korral). 

• LOENDAMISE PÕHIMÕTE: 

Rakke on vähe: 

• Loenda kogu Fuchs-Rosenthal’i kamber, s.o. 16 suurt ruutu ja jaga tulemus 3,2-ga, et saada teada, kui palju on rakke 1 µl 

NB! Kui kasutasid lahjendust, tuleb tulemus korrutada lahjendusastmega! 

Näiteks: Materjalist tehti 10x lahjendus 

Rakkude arv 16 suures ruudus : 3,2 x 10 = n rakku 1 µl 

Rakke on palju: 

• Loenda rakud 5 suures ruudus 
• Kuna kambri maht on 3,2 µl, siis ühe suure ruudu maht on 3,2 : 16 = 0,2 µl. Lugedes 5 suures ruudus olevad rakud saamegi rakkude arvu 1 µl (5 x 0,2 µl = 1 µl) 

NB! Kuna rakkude jaotumine on erinev, vali ruudud üle kogu kambri!